Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，是一類不具有蛋白編碼能力的RNA分子，能調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞生長、發(fā)育和代謝等基礎(chǔ)生物學(xué)過程中都扮演著重要的角色，甚至在癌癥等相關(guān)疾病形成過程中也起著關(guān)鍵的作用。高通量測(cè)序技術(shù)省去了煩瑣的Small RNA克隆文庫構(gòu)建過程，可以一次性生成上百萬條Small RNA序列，能夠快速鑒定特定條件下表達(dá)的已知Small RNA并發(fā)現(xiàn)新的Small RNA，同時(shí)還可以研究不同條件下Small RNA的表達(dá)差異，并可以聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

A workflow for Small RNA Sequencing

Jai PM et al., RNA Mapping, 2014

我們的優(yōu)勢(shì)

1. 針對(duì)動(dòng)物（包括外泌體）Small RNA（miRNA、piRNA、tsRNA）提供定制化實(shí)驗(yàn)分析方案;

2. 不僅能高效準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)并注釋非模式物種新的miRNA，還能進(jìn)行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究；

3. 及時(shí)更新miRBase、miRanda、RNAhybrid等專業(yè)miRNA數(shù)據(jù)庫以及靶基因預(yù)測(cè)算法，保證分析結(jié)果緊跟行業(yè)前沿。

樣本要求

組織樣品：

1. 動(dòng)物組織：>200mg；

2. 植物組織：>200mg；

3. 細(xì)胞培養(yǎng)：>2x10⁶個(gè)；

4. 全血：>3ml；

5. 菌體：>2x10⁶個(gè)或>300mg。

RNA樣品：

1. 請(qǐng)?zhí)峁�體積15 μL - 100 μL，總量≥10μg，濃度≥ 200ng/μL的RNA；

2. OD260/280介于1.8~2.2之間，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，確保RNA無降解；

3. 送樣時(shí)請(qǐng)標(biāo)記清楚樣品編號(hào)，管口使用Parafilm膜密封；

4. 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融；

5. 送樣時(shí)請(qǐng)使用干冰運(yùn)輸。

不同樣品之間存在差異，詳情請(qǐng)向我們咨詢

實(shí)驗(yàn)流程

    

1. 總RNA提取及質(zhì)控：RNA總量 > 1 μg ；RIN> 6.0

2. 小RNA富集：切膠范圍10-50bp

3. 小RNA質(zhì)控：Agilent 2200質(zhì)控

4. 文庫構(gòu)建：文庫分子18-30bp

5. 上機(jī)測(cè)序：Small RNA測(cè)序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等測(cè)序儀都可以完成。測(cè)序數(shù)據(jù)量40M reads。

數(shù)據(jù)分析流程

>>動(dòng)物小RNA

>>植物小RNA

結(jié)果示例

1、數(shù)據(jù)過濾對(duì)于原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，排除序列中的過短序列，低質(zhì)量序列，未測(cè)出序列，并去掉雙端接頭序列，以保證測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量與準(zhǔn)確性，我們將從堿基質(zhì)量，GC含量等角度對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，過濾后的數(shù)據(jù)稱為Clean Data（過濾后數(shù)據(jù)）。

堿基質(zhì)量結(jié)果圖（過濾后）

注：橫坐標(biāo)表示堿基位點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示堿基質(zhì)量值。

2、序列比對(duì)和長度分析由于Small RNA中成員較多，且各成員有各自的長度區(qū)間，我們首先會(huì)將測(cè)序得到的數(shù)據(jù)比對(duì)到分析物種的miRNA數(shù)據(jù)庫中，再將unmapped reads比對(duì)到NCBI數(shù)據(jù)庫中，對(duì)比對(duì)到不同數(shù)據(jù)庫中的small RNA（miRNA、piRNA和tsRNA）序列進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)，觀察各類small RNA的長度分布情況以及主峰所在的位置。

small RNA長度分布情況

注：左圖為miRNA長度分布圖；右圖為piRNA長度分布圖。

3、堿基偏好性分析成熟的miRNA在首位往往就具有U的偏好性，同時(shí)來源于生殖細(xì)胞的piRNA，其首位也通常具有U偏好性。因此，在進(jìn)行序列比對(duì)后，對(duì)于比對(duì)到不同數(shù)據(jù)庫中的small RNA序列進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)，觀察各類small RNA的堿基偏好情況。

small RNA堿基偏好性分析

注：橫坐標(biāo)表示序列長度，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的核苷酸。

4、表達(dá)量統(tǒng)計(jì)Small RNA測(cè)序最關(guān)鍵的步驟是對(duì)small RNA進(jìn)行定量表達(dá)和差異篩選，將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到各small RNA對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫后，采用表達(dá)量統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)于每一個(gè)small RNA的Counts數(shù)進(jìn)行標(biāo)化。

miRNAs表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析

An X et al., Theriogenology, 2016

注：該表格列舉了部分差異miRNAs的名稱和序列信息，NE（normalized expression）表示標(biāo)化后的miRNA表達(dá)量。

5、差異Small RNA篩選找到差異small RNA是整個(gè)研究的基礎(chǔ)，常用的差異篩選算法有DESeq、edgeR等，將表達(dá)量統(tǒng)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行差異篩選，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組 VS 對(duì)照組的差異情況，獲得差異倍數(shù)、顯著性（P-Value）以及誤判率（FDR），通過這些指標(biāo)篩選出顯著性差異的Small RNA。

差異miRNAs熱圖

An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

注：橫軸表示組別，縱軸表示不同miRNAs。

6、靶基因功能分析（GO Analysis）和信號(hào)通路分析（Pathway Analysis）采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數(shù)據(jù)庫，以及KEGG數(shù)據(jù)，對(duì)靶基因進(jìn)行功能和信號(hào)通路分析，得到靶基因所顯著性富集的功能條目和Pathway條目，并繪制集靶基因、功能和pathway于一體的network。

miRNA靶基因功能和pathway網(wǎng)絡(luò)圖

An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

注：該圖表示miRNA-204靶向的基因，及其靶基因所顯著富集的GO條目（右）和Pathway條目（左）。

1、Novel miRNA預(yù)測(cè)非模式物種中存在很多未被報(bào)道的Novel miRNA，將其找出并進(jìn)行研究是一項(xiàng)重要內(nèi)容，NovelBio團(tuán)隊(duì)協(xié)助研究者將比對(duì)到基因組的reads提取出來，然后用行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的算法，通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)自由能的計(jì)算，以及其他物種miRBase數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，最后獲得預(yù)測(cè)的Novel miRNA。

novel miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

An X et al, Theriogenology. 2016

注：該圖展示了進(jìn)一步分析與已知miRNA不匹配的測(cè)序reads預(yù)測(cè)的新的miRNA，這10個(gè)序列都具有顯著的莖-環(huán)發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2、Small RNA靶基因預(yù)測(cè)以差異的small RNA為研究對(duì)象，采用miranda算法與RNAHybrid算法進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，得到small RNA靶向到mRNA的3’UTR序列的靶基因結(jié)合位點(diǎn)，并繪制靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。

miRNAs靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015

注： 綠色表示下調(diào)的miRNAs，紅色表示上調(diào)的miRNAs。

3、Small RNA趨勢(shì)分析以各分組間的miRNA的TPM.txt文件為研究對(duì)象，采用STEM算法，進(jìn)行趨勢(shì)分析，得到按照樣本邏輯順序所在趨勢(shì)

DCs分化過程中miRNAs表達(dá)情況

Su XP et al., Nature Communications, 2013

注：該圖展示了DCs分化過程中miRNAs表達(dá)情況。H、I、M和R分別代表分化的四個(gè)階段：H—HSCs；I—imDCs；M—maDCs；R—DCreg，左上角的數(shù)字代表將391個(gè)miRNAs分成了26個(gè)clusters，左下角的數(shù)字代表每個(gè)cluster中miRNAs的數(shù)量，有顏色的clusters代表miRNAs顯著富集。

文獻(xiàn)示例

[1] Zheng L, Zhang X, Zhang H, et al. The miR164-dependent regulatory pathway in developing maize seed. Mol Genet Genomics. 2019 Jan 3. (IF=2.734)

[2] Xu C, Zhang H, Zhou W, et al. MicroRNA-10a, -210, and -563 as circulating biomarkers for ossification of the posterior longitudinal ligament. Spine J. 2018 Oct 20. pii: S1529-9430(18)31165-3. (IF=3.119)

[3] Wang Y, Zhang CY, Xia RH, et al. The MYB/miR-130a/NDRG2 axis modulates tumor proliferation and metastatic potential in salivary adenoid cystic carcinoma. Cell Death Dis. 2018 Sep 11;9(9):917. (IF=5.638)

[4] Chen X, Hao Z, Wei G, et al. The microRNA-10a/ID3/RUNX2 axis modulates the development of Ossification of Posterior Longitudinal Ligament. Sci Rep. 2018 Jun 15;8(1):9225. (IF=4.122)

[5] He Q, et al. Downregulation of miR-7116-5p in microglia by MPP1 sensitizes TNF-a production to induce dopaminergic neuron damage. Glia. 2017 Aug;65(8):1251-1263. (IF=6.2)

[6] Xu C, et al. Integrated microRNA-mRNA analyses reveal OPLL specific microRNA regulatory network using high-throughput sequencing. Sci Rep. 2016 Feb 12;6:21580. (IF=5.578)

[7] Liu R, et al. DNMT1-microRNA126 epigenetic circuit contributes to esophageal squamous cell carcinoma growth via ADAM9-EGFR-AKT signaling. Clin Cancer Res. 2015 Feb 15;21(4):854-63. (IF=8.193)

[8] Cheng T, et al. MeCP2 Suppresses Nuclear MicroRNA Processing and Dendritic Growth by Regulating the DGCR8/Drosha Complex. Dev Cell. 2014 Mar 10;28(5):547-60. (IF=14.08)

[9] Su X, et al. miRNomes of haematopoietic stem cells and dendritic cells identify miR-30b as a regulator of Notch1. Nat Commun. 2013;4:2903. (IF=10.02)

[10] Xu C, et al. miRNA -100 Inhibits Human Bladder Urothelial Carcinogenesis by Directly Targeting mTOR. Molecular Cancer Therapeutics. 2013, Feb 12:207-219. (IF=5.599)