是將染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）與二代測(cè)序相結(jié)合的表觀遺傳研究技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)對(duì)DNA和蛋白的相互作用進(jìn)行檢測(cè)，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。

ChIP-seq Assay Kit for Histone Methylation（Laboratorytalk，2016）

我們的優(yōu)勢(shì)

1. 定制化分析策略：根據(jù)不同測(cè)序方案和測(cè)序目標(biāo)，定制化選擇比對(duì)算法、Peak Calling算法以及注釋用數(shù)據(jù)庫(kù)區(qū)域信息；

2. 強(qiáng)大的自研能力：擁有已發(fā)表的自主開(kāi)發(fā)Peak Calling算法（Wang et al., BMC Bioinformatics, 2010）和定位注釋系統(tǒng)以及一系列下游分析工具；

3. 全面的數(shù)據(jù)庫(kù)整合：不斷更新基因組數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行多數(shù)據(jù)庫(kù)多版本整合，獲得準(zhǔn)確的Peak定位信息與注釋；

4. 強(qiáng)大的組學(xué)聯(lián)合分析能力：將ChIP-Seq與甲基化測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及全基因組測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，將單一的蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)更進(jìn)一步拓展。

樣本要求

注：前期免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)需客戶自主完成，我們提供測(cè)序和數(shù)據(jù)分析服務(wù)。

ChIP DNA樣品要求：

1. DNA總量≥20ng，濃度≥1ng/μL（Qubit檢測(cè)），體積要求20-100μL；

2. OD260/280介于1.8-2.0之間；

3. Agilent 2200質(zhì)檢合格，DNA樣本主峰范圍在100-500bp；

4. 電泳檢測(cè)無(wú)明顯RNA污染，基因組條帶清晰、完整，無(wú)降解；

5. 送樣時(shí)請(qǐng)標(biāo)記清楚樣品編號(hào)，管口使用Parafilm膜密封；

6. 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融；

7. 送樣時(shí)請(qǐng)使用干冰運(yùn)輸。

實(shí)驗(yàn)流程

1. 細(xì)胞交聯(lián)固定：甲醛處理細(xì)胞，將目標(biāo)蛋白與染色質(zhì)連結(jié)起來(lái)；

2. DNA超聲打斷：將基因組DNA打斷至100-500bp；

3. 免疫共沉淀：添加與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體，形成免疫沉淀復(fù)合物；

4. DNA片段回收：去交聯(lián)，純化DNA；

5. 文庫(kù)構(gòu)建：PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)；

6. 上機(jī)測(cè)序：建議使用Hiseq或NovaSeq測(cè)序平臺(tái)，數(shù)據(jù)量6Gb。

數(shù)據(jù)分析流程

結(jié)果示例

1、原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制采用Fastp軟件對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量序列，未檢測(cè)序列，接頭序列進(jìn)行過(guò)濾，并對(duì)于過(guò)濾前后數(shù)據(jù)的GC比值，堿基質(zhì)量，長(zhǎng)度分布，接頭留存，Duplication比率等指數(shù)進(jìn)行分析。圖1中部分展示了raw data質(zhì)控結(jié)果。

堿基質(zhì)量結(jié)果圖

注：左圖橫坐標(biāo)代表堿基位點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表堿基質(zhì)量值，不同顏色曲線代表不同堿基在每條read上的質(zhì)量值；右圖橫坐標(biāo)代表堿基位點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表堿基含量比值，不同顏色曲線代表不同位點(diǎn)各堿基含量。

2、DNA基因組比對(duì)（DNA Mapping）采用Bowtie2算法將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組上，得到基因組比對(duì)的bam文件，并基于bam文件進(jìn)行信息統(tǒng)計(jì)，得到基因組比對(duì)率、reads在染色體上的分布情況。

DNA mapping結(jié)果圖

注：左圖為reads在基因組上的比對(duì)情況；右圖為reads在染色體上的分布情況，灰色柱子表示每條染色體上堿基數(shù)占基因組的比例，綠色柱子表示比對(duì)到染色體上reads的堿基數(shù)占基因組的比例。

3、Peak Calling和Peak注釋（Peak Annotation）采用MACS2算法對(duì)DNA Mapping后的bam文件進(jìn)行peak峰的檢測(cè)，得到ChIP樣本中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或組蛋白修飾的富集區(qū)域，即peak區(qū)域。并采用Chipseeker算法對(duì)peak進(jìn)行注釋，得到peak對(duì)應(yīng)的基因以及所在的基因結(jié)構(gòu)，包括啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)等。此外，我們還可以采用deeptools軟件對(duì)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)測(cè)序序列的覆蓋情況進(jìn)行繪圖，得到reads在peak區(qū)域或基因結(jié)構(gòu)上的分布情況。

peak數(shù)量及其在基因結(jié)構(gòu)上的分布情況

Twohig JP et al., Nat Immunol, 2019

注：左圖為不同分組peak在基因組結(jié)構(gòu)上的占比情況，右圖為不同分組peak的總數(shù)量。

4、Motif分析（Motif Analysis）采用HOMER/MEME算法以及JAPSAR數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)peak區(qū)域進(jìn)行motif分析，得到潛在的motif特征序列。

特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motifs的富集情況

Twohig JP et al., Nat Immunol, 2019

注：MEME與STAMP/Jaspar軟件共同對(duì)STAT1和STAT3預(yù)測(cè)出來(lái)的binding Motif。

5、功能分析（GO Analysis）信號(hào)通路分析（Pathway Analysis）分別采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO數(shù)據(jù)庫(kù)，以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Peak Annotation的相關(guān)基因進(jìn)行功能分析和信號(hào)通路分析，得到這些基因群體所顯著性富集的GO條目和Pathway條目。

GO分析結(jié)果

Zhang QT et al., Theranostics. 2019

注：左圖為下調(diào)基因所顯著富集的GO條目（Top 10），右圖為上調(diào)基因所顯著富集的GO條目（Top 10）。

1、IGV截圖采用igvtools算法將基因組比對(duì)后bam文件轉(zhuǎn)換為tdf格式，通過(guò)IGV軟件對(duì)目標(biāo)基因附近的peak分布情況進(jìn)行可視化展示。

ISL1靶基因處peak分布情況

Zhang QT et al., Theranostics. 2019

注：該圖展示了ISL1靶基因附近H3K4me1、H3K27ac和ISL1的peak分布情況，箭頭表示結(jié)合的peak。

2、基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(Gene-Act-Network Analysis)以顯著性GO Analysis和顯著性Pathway Analysis的和組蛋白相關(guān)的表型基因?yàn)檠芯磕繕?biāo)，采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)基因間關(guān)系注釋，繪制Gene-Act-Network。

基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

Gao et al., Cancer. 2015

注：Profile1、2、4基因集間基因互作網(wǎng)絡(luò)圖。

文獻(xiàn)示例

[1] Twohig JP, Cardus Figueras A, Andrews R, et al. Activation of naïve CD4+ T cells re-tunes STAT1 signaling to deliver unique cytokine responses in memory CD4+ T cells. Nat Immunol. 2019 Apr;20(4):458-470. (IF=21.809)

[2] Mirtschink P, Bischof C, Pham MD, et al. Inhibition of the HIF1α-Induced Cardiospecific HERNA1 eRNA Protects from Heart Disease. Circulation. 2019 Mar 29. (IF=18.88)

[3] Han X, Huang H, Gao P, et al. E-protein regulatory network links TCR signaling to effector Treg cell differentiation. PNAS. 2019 Feb 15. pii: 201800494. (IF=9.504)

[4] Zhang QT, Zhang QQ, Jiang X, et al. Collaborative ISL1/GATA3 interaction in controlling neuroblastoma oncogenic pathways overlapping with but distinct from MYCN.Theranostics. 2019; 9(4): 986–1000. (IF=8.537)

[5] Ranjit M, Hirano M, Aoki K , et al. Aberrant Active cis-Regulatory Elements Associated with Downregulation of RET Finger Protein Overcome Chemoresistance in Glioblastoma. Cell Rep. 2019 Feb 26;26(9):2274-2281.e5. (IF=8.032)

[6] Gao Y, et al. Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced offtarget effects. Genome Biol. 2017 Feb 1;18(1):13. (IF=9.202)